İkinci kez inşa edilen kilisenin tamamen talan edilmesinden çok kısa bir süre sonra, Büyük Jüstiniyen ayaklanmalarının tamamını bastırdı ve hasarlı ve yıkılan ne varsa hepsinin yeniden inşaasını başlattı.

Justiniyen, aynı yerde eskisinden daha görkemli olmak kaydı ile yeni bir kilise inşaası için Tralles’li (Aydın’lı) Anthemius ve Miletli Elder Isisore’u görevlendirdi. Anthemius ve Isidore mimar olarak anılmıyorlardı, onlar mekanik bilimin ustaları anlamına gelen “mechanikoi” olarak adlandırılıyorlardı. Gerçekten Anthemius matematikçi ve fizikçi idi ve Isidore da geometri ve mekanik profesörü idi. Ayasofya inşaatından önce her ikisinin de bir inşaat tecrübesi olmamıştı. Ama buna rağmen dünyanın en önemli yapılarından birini yaratmayı başardılar.

Yeni yapının inşaası Nika ayaklanmasının bitiminden çok kısa bir süre sonra başladı. Birçok yapı malzemesi Imparatorluğun değişik yerlerinden getirtildi. Sarı taşlar Suriye’den, Porfir taşı Mısır’dan, Hellen tarzı sütunlar Efes’in Artemis Tapınağı’ndan getirtildi. Yapının inşaası için 10bin den fazla işçi çalıştı ve üçüncü kilise 27 Aralık 537 senesinde büyük bir törenle Imparator tarafından açıldı. Kilisenin mozaik dekorasyonları daha sonra Imparator II. Justin zamanında (565-578) tamamlandı.

Yaşanan çok sayıda depremden sonra yapı hasar gördü. 553 Ağustos’unda ve 557 Aralığında yaşanan depremler ana kubbede ve doğu cephedeki yarım kubbede bazı çatlakların oluşmasına sebep oldu. 558 Mayıs depreminde ana kubbe tamamen çöktü ve bu çöküşle vaaz kürsüsü, kurban kesme yeri ve onun üzerindeki kutsanmış ekmek kabı da tamamen hasar gördü.Bu kez Miletli Isodore’un yiğeni genç Isodorus kubbeyi yeniden inşa etmekle görevlendirilen kişi oldu. Genç Isodorus kubbeyi 6,25 m daha yukarıya yani 55,6 m olan  bugünkü yüksekliğine getirerek inşa etmiştir. Patrik Eutcyhius başkanlığında yeniden tamir gören katedral 23 Aralık 562 senesinde yeniden açılmıştır. Istanbul’daki Ortodoks Patrikliğinin merkezi haline gelen bu yapı aynı zamanda imparatorluk törenlerinin de düzenlendiği yer olarak kullanılmaya başlandı.

726 senesinde, Imparator Leo Isaurian’ın emri ile kilise, tüm azizlere ait resimlerden, dini tablolardan ve heykeller gibi dini unsurlardan arındırıldı. Bunun nedeni imparatorun bu tür görüntülere olan saygısıydı. 829-842 yıllarında Imparatorluk yapan Theophilus’un Islam sanatına düşkünlüğü vardı ve bu nedenle kilisenin güney girişini monogramlarla süsledi. 

859 senesinde çıkan bir yangında ve hemen ardından 869 senesinde oln bir depremden Ayasofya hasar gördü. Deptremde kubbenin yarısı çöktü ve Imparator I. Basil’in emri ile tamir edildi. 25 Ekim 989 da yaşanan başka bir depremle kubbe yine hasar gördü. Bu kez de Imparator II. Basil mimar Trdat’a kubbeyi tamir görevini verdi. 13 Mayıs 994 de yapının inşaası tamamlandı.

4. Haçlı seferlerinde, Ayasofya Latin Hristiyanlar tarafından yağmalandı ve çok sayıda kiliseye ait malzeme ve önemli emanetler batıdaki müzelere götürüldü. Latinlerin Konstantinapolis’i işgali ile 1204 ve 1261 yılları arasında, Ayasofya kilisesi Roma Katolik Katedrali olarak kullanıldı. 1261 de Bizans Konstantinapolis’i yeniden ele geçirdi. 1317’de Imparator Andronicus kilisenin doğu ve kuzey bölümlerine 4 adet destekleyici payanda inşaası emrini verdi.

1344 senesindeki depremle kubbe yeniden bazı yerlerinden çatladı ve 19 Mayıs 1346 da yapının bazı yerleri çöktü. Mimar Astras ve Peralta tarafından yürütülen inşaa ve tamir çalışmaları 1354 senesinde tamamlanabildi. Bu zamana kadar kilise kapalı kaldı